Специфичные для бешенства антитела: измерение суррогатов защиты от фатальной болезни

  1. Аннотация Антитела играют центральную роль в профилактике многих инфекционных агентов. Хотя нейтрализация...
  2. методы
  3. Роль специфических для бешенства антител в профилактике заболеваний
  4. Методы обнаружения и измерения антител к вирусу бешенства
  5. Таблица 1
  6. Стандартизация и валидация методов
  7. Выводы
  8. Вставка 1. Учебные очки
  9. Вставка 2. Ключевые ссылки на местах

Аннотация

Антитела играют центральную роль в профилактике многих инфекционных агентов. Хотя нейтрализация является основной функцией антител, Fc- и комплемент-зависимая активность этих многофункциональных белков также может иметь решающее значение в их способности обеспечивать защиту от большинства вирусов. Защита от вирусных патогенов in vivo является сложной, и хотя нейтрализация вируса - способность антитела инактивировать инфекционность вируса, часто измеряемая in vitro, - важна, она часто является лишь частичным фактором защиты. Тест на быстрое ингибирование флюоресцентного фокуса (RFFIT) остается «золотым стандартом» для измерения антител, нейтрализующих вирус бешенства. В дополнение к нейтрализации, специфическая антигенсвязывающая активность антител против бешенства может быть измерена с помощью иммуноферментных анализов (ELISA), а также других доступных методов. Для любого заболевания, при выборе подходящего анализа (ов) для оценки титров антител, валидация анализа и способ их интерпретации являются важными соображениями, но для такого смертельного заболевания, как бешенство, они имеют первостепенное значение. При выборе метода анализа и для интерпретации результатов, которые могут быть истолкованы как суррогат, должны быть тщательно рассмотрены врожденные ограничения одномерного лабораторного теста для измерения антител к бешенству, а также валидация выбранного метода. защиты.

Вступление

Хочет ли работник по контролю за животными определить, необходим ли усилитель вакцины против бешенства для установления приемлемого статуса до заражения, или врач рассматривает причины энцефалита у ребенка, или владелец собаки с ослабленным иммунитетом обеспокоен тем, что собака Реакция на вакцинацию против бешенства не будет достаточной для прохождения серологического теста, позволяющего им путешествовать в зону, свободную от бешенства, или исследователь пытается определить, адекватен ли ответ на вакцину против бешенства в популяции енотов, или нужно назначить значение потенции для продукта бешенства иммуноглобулина, все требуют точной оценки на основе измерения циркулирующих антител. В каждой из этих ситуаций измерение или просто обнаружение нейтрализующих вирус бешенства или других антител поможет решить этот вопрос. Однако так же, как обстоятельства в каждом из этих сценариев различны, специфика метода, выбранного для измерения антител, нормативные требования к тестированию и цель тестирования в каждой из этих ситуаций различны. Антитела возникают в результате гуморального иммунного ответа на антигены бешенства, процесс которого контролируется многими факторами, включая количество антигена, путь доставки, экспрессию и участие генов главного комплекса гистосовместимости (МНС), а также состояние здоровья индивидуальный, среди других. Понимание иммунного ответа хозяина, включая подкласс (тип) иммуноглобулина (Ig), а также кинетику и долговечность ответа, необходимо для получения показателя или степени иммунитета против бешенства.

Первоначально измерение нейтрализующих вирус бешенства антител (RVNA) проводили in vivo с использованием теста нейтрализации мыши (MNT). Впоследствии тест на быстрое ингибирование флюоресцентного фокуса (RFFIT) был признан «золотым стандартом» в тесте in vitro. [1] , Методы измерения иммунитета против бешенства варьируются в зависимости от измеряемого гуморального компонента (то есть подкласса Ig или функциональной активности) и характеристик эффективности (т.е. специфичности или чувствительности), а также стоимости и сложности метода. Понимание каждого из этих уникальных факторов имеет важное значение при выборе и правильном использовании метода и одинаково важно при интерпретации результатов, полученных из методов. Кроме того, нормативные акты (например, от Управления по контролю за продуктами и лекарствами США (USFDA), Европейского союза, Всемирной организации здравоохранения животных), которые требуют проверенных и утвержденных методов испытаний для измерения образования антител к вирусу бешенства, актуальны при транспортировке домашних животных и при бешенстве. производство и оценка биопрепаратов для использования людьми и животными. В этом обзоре мы обсуждаем следующее (1) роль антител против бешенства в профилактике заболеваний, (2) методы, которые можно использовать для обнаружения и измерения, и (3) соображения и текущие требования к стандартизации и валидации методов ,

методы

Обзор литературы проводился с использованием онлайн-базы данных PubMed с 1975 по 2008 год с медицинскими рубриками Национальной медицинской библиотеки США (MeSH). Списки литературы по отдельным статьям и обзорам были также индивидуально исследованы. Кроме того, были опубликованы неопубликованные данные по серологии бешенства в лаборатории бешенства Канзасского государственного университета.

Роль специфических для бешенства антител в профилактике заболеваний

Модели защиты животных от бешенства продемонстрировали существенную роль РВНК [2] , [3] , Действительно, одна только РВНК может приводить к вирусному клиренсу из центральной нервной системы (ЦНС) экспериментально инфицированных мышей [4] , Большинство антител против бешенства направляются на эпитопы гликопротеина вируса бешенства, хотя некоторые могут специфически распознавать нуклеопротеин [5] , [6] , Как специфические антитела против бешенства нейтрализуют вирус, не совсем понятно с точки зрения того, какие специфические эпитопы или подклассы Ig вовлечены [7] , [8] , Один вирион бешенства может связывать до 1000 молекул некоторых антигликопротеиновых моноклональных антител без нейтрализации, предполагая, что нейтрализация вируса, вероятно, включает в себя нечто большее, чем просто связывание антител с эпитопами вириона. [7] , [8] , Можно предположить, что антитела, которые нейтрализуют вирус in vitro, более эффективны в процессе, который приводит к защите от вирусной инфекции in vivo, чем антитела, которые не нейтрализуют вирус in vitro. Часть Fc антител одна имеет специфические биологические функции, включая активацию антигенпрезентирующих клеток и каскад комплемента. Таким образом, ожидается, что цельный IgG будет более эффективным, чем эпитоп-специфичные F (ab) 2-порции нейтрализующих антител. [9] , С разработкой молекулярных методов конструирования специфичности Fab-фрагментов антител и интактных моноклональных антител для диагностических и терапевтических целей важность понимания того, как антитела нейтрализуют вирус бешенства механически, становится все более важной. Поскольку с практической точки зрения трудно предсказать способность препарата поликлональных или моноклональных антител нейтрализовать вирус путем измерения авидности или аффинности антител, сначала необходимо определить активность нейтрализации некоторыми способами in vitro, даже если только для оценки естественная активность. Тем не менее, препарат антител против бешенства, который демонстрирует сильную нейтрализацию in vitro, может все еще не защищать in vivo [10] ,

Вирус бешенства очень нейротропен. Внутри ЦНС инфекция вируса бешенства развивается по большей части незамеченной адаптивными иммунными реакциями хозяина до тех пор, пока инфекция не достигнет своей последней стадии. В дополнение к инфекции, которая развивается в этом иммунно-привилегированном сайте, вирус бешенства способен подорвать любой возникающий иммунный ответ хозяина, и, следовательно, исход инфекции является фатальным почти в 100% случаев. Напротив, вакцина против бешенства способна стимулировать высокий уровень циркулирующей РВНК. Вот почему иммунитет после контакта с вирусом бешенства у непривитого человека, вызванного быстрым очищением раны для снижения вирусной нагрузки в месте воздействия и введением специфического к бешенству Ig с последующей серией прививок против бешенства, практически на 100% эффективен в предотвращении инфекционное заболевание. Пассивная защита от бешенства Ig (RIG) имеет решающее значение для немедленной нейтрализации большинства инфекционных вирионов, предотвращая распространение вируса в ожидании индукции адаптивного иммунного ответа хозяина. В целом, вакцины против бешенства исторически представляют собой убитые цельные вирусные вакцины, которые, как ожидается, будут стимулировать разработку антител против вируса бешенства наряду с ответом CD4 + Т-лимфоцитов, который включает продукцию цитокинов. Ответ поликлональных антител каждого человека на вакцинацию против бешенства представляет собой уникальную смесь специфических особенностей антигенов вируса бешенства. Хотя большинство людей вырабатывают различные измеримые антитела в ответ на вакцинацию до или после облучения, могут быть значительные различия в нейтрализующей активности и количестве продуцируемой РВНК.

Антитела развиваются из внутренних реакций хозяина и в ответ на внешние факторы, такие как количество вводимого антигена, тип антигена и путь воздействия или вакцинации. Например, было продемонстрировано, что чем эффективнее вакцина, тем выше уровни РВНК, которые индуцируются у людей. [11] , Другие исследования показали, что тип вакцины и способ вакцинации влияют на уровень антител как через 14 дней, так и через год после вакцинации. [12] , Кроме того, иммунный ответ T-хелпера типа 2 (Th2) на убитую вакцину по своей природе отличается от активации иммунитета T-хелпера типа 1 (Th1) живой вирусной вакциной. В дополнение к факторам хозяина, таким как возраст и общее состояние здоровья, адаптивный иммунный ответ индивидуума требует связывания чужеродных пептидов с молекулой МНС на антигенпрезентирующих клетках и стимуляции соответствующего клона Т-клеток этой конкретной комбинацией МНС-пептид. Разнообразие генов в комплексе МНС, состоящем из сотен аллелей, влияет на вариацию иммунного ответа на вакцинацию [13] , Иммунные ответы гуморального (Th2) и клеточного (Th1) типа в основном направлены на выработку цитокинов, включая созревание ответа антител и генерацию подкласса Ig. Также наблюдалась дихотомия ответов при вакцинации против бешенства среди людей с высокими или хорошими респондентами и с плохими или низкими респондерами. [14] , Прогнозы относительно долголетия ответа РВНК могут быть сделаны на основе уровня и времени пикового ответа на вакцинацию. [12] , [14] ,

Методы обнаружения и измерения антител к вирусу бешенства

Методы, доступные для обнаружения и измерения антител, специфичных к вирусу бешенства, - это либо антигенсвязывающие анализы, либо анализы нейтрализации вируса. В антигенсвязывающих анализах антитела в сыворотке или спинномозговой жидкости (CSF) выявляются, количественно и характеризуются своей способностью связываться с различными антигенами вируса бешенства, из целого вируса, очищенных субъединиц или специфических пептидов, которые имитируют эпитопы. Такие анализы определяют аффинность, авидность и специфичность связывания антител. Обычно эти способы включают в себя фиксацию антигена на твердой поверхности, то есть пробирке, пластине или шарике. Взаимодействие между антителом и антигеном затем визуализируется и количественно оценивается различными системами обнаружения, которые включают развитие окраски посредством реакции фермент-субстрат или связывания вторичного антитела, конъюгированного с флуоресцентным маркером или стафилококковым белком A / G, с первичным антителом связан с антигеном. Эти анализы могут быть использованы для измерения антител, которые реагируют на внутренние вирусные белки, структурные или ферментные, а также для оценки уровней антител, которые связываются с внешними белками, против которых направлены нейтрализующие антитела. Напротив, современные анализы нейтрализации вируса представляют собой клеточные анализы, которые обнаруживают функциональную активность антител в сыворотке или CSF против живого вируса. Механизм нейтрализации вируса в клеточной культуре (анализ in vitro) зависит от взаимодействия между эпитопом вириона и паратопом (специфическим противодействующим сайтом) антитела и может также зависеть от характеристик рецепторов клеток, на которых проводится анализ. выполняется [15] , Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что вирус инфицирует клетки нейронального происхождения с использованием рецепторов никотинового ацетилхолинового рецептора, рецептора фактора роста нервных клеток с низким сродством или молекулы адгезии нервных клеток, в то же время заражая клетки, не являющиеся ЦНС, с использованием других неопознанных рецепторов. [16] , [17] , Результаты анализа нейтрализации вируса основаны на измерении роста вируса в клеточной культуре, то есть на определении того, избегает ли вирус нейтрализации или нет. Анализы связывания, с другой стороны, измеряют другой набор характеристик бешен-специфического Ig-ответа по сравнению с анализами нейтрализации. Следовательно, результаты анализов связывания не являются априори непосредственно сопоставимыми с результатами нейтрализации [7] , При соответствующей проверке и пригодности для предполагаемой цели анализы связывания можно использовать для определения наличия или отсутствия антиген-специфических антител, а в некоторых случаях подклассов Ig, которые можно использовать в качестве аппроксимации или подтверждения ответа нейтрализующего антитела. Цель тестирования определит, какие методы являются наиболее подходящими. Например, обнаружение специфических антител к вирусу бешенства в CSF является диагностикой инфекции бешенства, независимо от того, является ли проведенный тест одним из анализов связывания (например, для фиксированного цельного вируса на предметном стекле, который обнаруживается с помощью антивидовых IgG или IgM) или анализ нейтрализации (такой как RFFIT). Активность антител, обнаруженная в сыворотке, может указывать на предшествующую вакцинацию или, если она присутствует, с клиническими признаками бешенства, активной инфекции или даже, в очень редких случаях, на предшествующее воздействие вируса бешенства, которое не привело к клинической инфекции [18] или в выживании инфекции человеком [19] , Для полного определения иммунитета к бешенству требуется высокоспецифичный анализ и способность обнаруживать чрезвычайно низкие уровни антител, а часто и специфические подклассы, такие как IgM и IgG. Анализы связывания могут быть легче разработаны для достижения этих требований посредством использования специфических, чистых антигенов и надежных систем обнаружения (считывания). Тем не менее, мера защиты от бешенства лучше всего аппроксимируется с помощью теста на нейтрализацию вируса. Поскольку экспериментальные методы заражения вирусом никогда не будут выполняться на людях, используются суррогатные экспериментальные модели защиты животных, основанные на полевых наблюдениях и количестве и продолжительности сывороточных нейтрализующих антител, измеренных методами in vitro.

Изменяя различные компоненты, такие как штамм вируса, систему обнаружения и т. Д., Анализа, можно индивидуально разработать анализ «соответствия цели». Например, обнаружение РВНК в конкретной колонии видов летучих мышей, связанных с вариантом вируса бешенства, может быть «конкретно» измерено с использованием в анализе in vitro предполагаемого варианта вируса бешенства, циркулирующего среди летучих мышей, в качестве вируса заражения. Чувствительность метода испытаний можно регулировать путем изменения количества дозы антигена или вируса заражения, чтобы более точно определять и определять низкие уровни антител или наличие неспецифических или перекрестно реагирующих антител или веществ. Для анализов связывания, таких как иммуноферментный анализ (ELISA), меченный анти-IgM в качестве вторичного антитела обнаруживает только антитела против вируса бешенства IgM в качестве первичного антитела. Уровень анти-IgM можно сравнить с уровнем анти-IgG в том же образце, выполнив тот же анализ, но используя меченый анти-IgG в качестве вторичного антитела. В конкурентном методе ELISA используется конкурирующее моноклональное антитело к эпитопу белка бешенства и измеряется способность антител в тестируемом образце (сыворотке или CSF) превосходить моноклональное антитело за прикрепление к этому конкретному эпитопу. [20] , Это делает анализ очень специфичным для измерения антител, которые связываются со специфическим эпитопом на данном белке бешенства [21] , Кроме того, могут быть внесены изменения в методы анализа, чтобы их было проще выполнять и стандартизировать для использования в самых разных средах и лабораториях. Например, молекулярные методики с использованием псевдотипированных вирусов в качестве векторов, таких как лентивирусная векторная система, для экспрессии гликопротеина бешенства имеют несколько преимуществ. Они обеспечивают способность (а) стандартизировать целевой эпитоп; (б) тест на нейтрализацию против нескольких штаммов или генотипов вирусов; (c) использовать более низкий уровень практики биологической опасности (то есть сделать их потенциально более безопасными, чем использование живого вируса бешенства), и (d) повысить экономичность методов испытаний [22] , Вот некоторые из факторов, которые следует учитывать при выборе метода, который «подходит по назначению».

Определение порогового значения (т. Е. Точки, которая указывает на сероконверсию или определение адекватной вакцинации) является специфическим для каждого метода тестирования и имеет решающее значение для интерпретации результатов. В целом, сывороточный титр нейтрализации 1-100 (90% конечного титра) приемлем как эффективный, даже если уровни антител в ткани могут быть на самом деле ниже. [23] , Титр антител (уровень) 0,5 МЕ (международные единицы) / мл, который признан во всем мире, впервые упоминается в восьмом докладе Комитета экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по бешенству, 1992 год. Что касается вакцинации перед воздействием в отчете говорится: «Всем людям, которые работают с живым вирусом бешенства в диагностической, исследовательской или производственной лаборатории, должен иметь образец сыворотки, проверенный на антитела, нейтрализующие вирус бешенства, и бустер, вводимый, когда титр падает ниже 0,5 МЕ / мл». В отчете также рекомендуется определять уровень РВНК с помощью МНТ или RFFIT с использованием штамма вируса общего заражения [24] , Ясно, что уровень 0,5 МЕ / мл был установлен как показатель адекватной вакцинации (не защита!) У людей с риском заражения бешенством, и что это относится к использованию теста нейтрализации сыворотки со стандартным штаммом вируса заражения. В США рекомендации Консультативного комитета по практике иммунизации (ACIP) гласят: «Если титр падает ниже минимально приемлемого уровня антител для полной нейтрализации при разведении сыворотки 1–5, однократная бустерная доза вакцины перед воздействием составляет рекомендуется для лиц с постоянным или частым риском заражения бешенством »(минимальный приемлемый уровень антител не определен в МЕ / мл) и рекомендовать метод RFFIT для тестирования [25] , Поэтому, когда другие методы используются для измерения антител против бешенства у людей или когда RFFIT используется для других видов (не людей), принятый уровень 0,5 МЕ / мл может не применяться. В обзоре исследований по заражению бешенством были предложены действительные предельные значения для результатов RFFIT у кошек и собак в 0,1 и 0,2 МЕ / мл соответственно, соответственно. [2] , Уровень 0,5 МЕ / мл методами RFFIT или FAVN признан регулирующими органами в большинстве районов, свободных от бешенства, как доказательство адекватного ответа на вакцинацию для ввоза кошек и собак [26] , При сравнении результатов тестирования сывороток енота с помощью RFFIT и коммерческого ветеринарного набора ELISA аналогичные показатели чувствительности и специфичности получают только при использовании различных пороговых значений (см.). Для сывороток енотов, протестированных с помощью RFFIT, установка уровня отсечения на 0,5 МЕ / мл допускает возможность присутствия неспецифических ингибиторов в сыворотке дикой природы, что может давать ложноположительные результаты, если уровень отсечки также установлен низкий. Часто метод ELISA менее чувствителен к влияющим веществам, потому что разведение сыворотки, используемое в анализе, обычно выше. Измерения выше 0,1 EU (эквивалентные единицы) / мл, по-видимому, являются специфическими для этого набора образцов с использованием этого конкретного набора для испытаний. При мониторинге поглощения приманки у енотов в программах оральной приманки более важно использовать метод, который оценивает уровни потенциального иммунитета населения, чем определять степень защиты у отдельного енота. Использование различных предельных значений в исследованиях при сравнении результатов, полученных одним и тем же методом, может привести к неверным выводам. Таким образом, анализ и пороговое значение, которое может отличить привитых от невакцинированных енотов, становится лучшим методом «соответствия цели». Точно так же уровень отсечения является значительным при изучении реакции человека на вакцину против бешенства, которая сравнивает три метода ELISA с методом RFFIT, используя пороговое значение сероконверсии 0,5 МЕ / мл. [27] , Расчеты и, следовательно, выводы, сделанные на основе результатов RFFIT сероконверсии, будут варьироваться в зависимости от используемого уровня отсечки, либо 0,5 МЕ / мл, либо принятого ACIP уровня полной нейтрализации при разведении 1-5. Например, определение показателей чувствительности и специфичности методов ELISA по сравнению с результатами RFFIT, интерпретируемыми как отрицательные или положительные для сероконверсии по уровню ACIP, а не по уровню 0,5 МЕ / мл, используемому в статье, даст разные значения [27] , В этих двух примерах подходящее пороговое значение должно определяться и определяться для каждого метода, а также в связи с целью тестирования и нормативными требованиями. В дополнение к установлению соответствующих предельных уровней для конкретных методов регулирующие органы, такие как Европейская фармакопея, USFDA или национальные органы по импорту в районах, свободных от бешенства, могут также потребовать лабораторной валидации и одобрения или сертификации.

Таблица 1

Обобщение результатов серологического исследования на бешенство у 100 субъектов-енотов (50 вакцинированных / 50 невакцинированных) в сравнении методов RFFIT и ELISA.

Уровень отсечения Статус вакцинации Специфичность Чувствительность Да Нет 0,1 МЕ / мл или ЕС / мл. Результат ELISA # выше порога 35 0 1,00 0,77 # ниже порога 15 50 RFFIT Результат # выше порога 42 10 0,83 0,86 # ниже порога -off 8 40 0,5 МЕ / мл или ЕС / мл. ELISA Результат # выше порога 24 0 1,00 0,66 # ниже порога 26 50 RFFIT Результат # выше порога 32 1 0,98 0,74 # ниже порога 18 49

Стандартизация и валидация методов

Стандартизация методов серологического теста на бешенство имеет важное значение для обеспечения значимого сравнения характеристик и активности антител у вакцинированных или подвергшихся воздействию людей. Это становится особенно актуальным, когда результаты серологического исследования бешенства сравниваются между различными лабораториями и разными исследованиями во времени. Тест на нейтрализацию вируса флуоресцентных антител (FAVN) был частично разработан для стандартизации различных модификаций RFFIT. [28] , Переменные в тесте, которые включают заражающий вирус, антитела, клетки-мишени и предельные значения, должны быть стандартизированы, чтобы результаты теста были сопоставимыми. Например, при использовании цельного вируса бешенства по сравнению с гликопротеином вируса бешенства в качестве антигена в непрямом тесте ELISA, где все остальные переменные стандартизированы, результаты не должны быть сопоставимыми. В большинстве тестируемых образцов большинство анализируемых антител к вирусу бешенства будут направлены против гликопротеина, но антитела к нуклеопротеиновым и фосфопротеиновым антигенам вируса не являются редкостью и будут обнаружены в непрямом ELISA на основе всего вируса. [29] , При измерении активности моноклональных антител важно учитывать, что специфичность антитела к одному эпитопу может быть недостаточной для нейтрализации всех вариаций эпитопа (антигена) штамма вируса, вызывающего заражение, или даже ряда квази-видов в одном вирусный запас [30] , [31] , Точно так же различные штаммы вируса заражения могут влиять на результаты, полученные при тестировании на нейтрализацию сыворотки. В исследовании на людях, которые сравнивали сывороточные титры, измеренные in vitro, со штаммами заражающего вируса, которые были либо гомологичными, либо гетерологичными по отношению к вакцинному штамму, выявлено, что у большинства субъектов более высокие титры были обнаружены в отношении гомологичного штамма. [32] , Кроме того, как высокие, так и низкие дозы вируса заражения могут влиять на определение активности бешенства Ig [33] , Использование общепризнанного стандартного контроля сыворотки против бешенства в качестве эталона стандартизирует результаты метода и позволяет преобразовывать измерения (например, титры, показания оптической плотности и т. Д.) В признанные единицы, такие как МЕ / мл или ЕС / мл.

Международные эталонные стандарты для продуктов RIG, используемых сегодня, включают первый Международный стандарт ВОЗ по иммуноглобулину против бешенства, второй Международный стандарт ВОЗ по иммуноглобулину против бешенства и эталонную сыворотку RIG собачьей вакцины Office International des Épizooties (OIE). Эффективность каждого из этих продуктов была установлена ​​с помощью методов нейтрализации сыворотки. [34] - [36] , Оригинальная стандартная эталонная сыворотка RIG, которая была лошадиного происхождения, была создана в 1955 году. Исходя из веса лиофилизированного продукта 86,6 мг на ампулу, было назначено значение потенции 86,6 МЕ. Первая эталонная сыворотка RIG ВОЗ человеческого происхождения была получена из объединенных сывороток от вакцинированных людей. Потенциал RIG человека был установлен путем межлабораторных испытаний на стандартном RIG лошади в RFFIT, проведенном в шести лабораториях. Тест включал два разведения (низкое и высокое) продукта в четырех повторных анализах. После статистического анализа потенция в 59 МЕ была назначена в 1984 году в соответствии с первым международным стандартом ВОЗ по RIG. Аналогичным образом, в 1993 году был протестирован второй пул сывороток от вакцинированных людей с назначением потенции 30 МЕ и установленным в качестве второго Международного стандарта ВОЗ на контрольную сыворотку для RIG. Эталонная сыворотка RIG, используемая в США, партия R-3, является частью партии, которая стала первым международным стандартом ВОЗ для эталонной сыворотки RIG. Эталонная сыворотка RIG для собак МЭБ обладает эффективностью 6,7 МЕ, и партии этого продукта откалиброваны в соответствии со вторым Международным стандартом ВОЗ для эталонной сыворотки RIG. Относительные потенции этих двух эталонных сывороток ВОЗ для РИГ человека были сравнены USFDA в 1997 году и еще раз Лабораторией бешенства Канзасского государственного университета в 2006 году. Это сравнение показало снижение относительной активности первого международного стандарта ВОЗ по отношению к потенции ВОЗ. Второй международный стандарт - 2,5% в 1997 году и 14% в 2006 году. Эти различия не считаются статистически значимыми, но они иллюстрируют эффект использования различных эталонных стандартов при сравнении результатов серологического исследования бешенства и важность контроля и стандартов контроля качества.

Использование значений активности для RIG, которые назначаются с помощью методов нейтрализации сыворотки, в отличие от значений, определяемых с помощью анализов связывания, является неуместным и проблематичным. иллюстрирует расхождения, которые могут возникать, когда различные эталонные сыворотки RIG с одинаковой эффективностью, определенной нейтрализацией сыворотки, используются для расчета значений эффективности, полученных методом ELISA. Когда первую и вторую контрольную сыворотку RIG ВОЗ разводят до 2,0 МЕ / мл для получения аналогичных значений эффективности с помощью RFFIT, результаты ELISA не совпадают. Таким образом, если первая RIG ВОЗ используется в качестве контрольного для стандартной кривой в анализе ELISA, будут получены более низкие результаты, чем при использовании второй RIG ВОЗ.

Международный стандарт RIG Reference SERAМеждународный стандарт RIG Reference SERA.

Первый SRIG ВОЗ и второй SRIG ВОЗ разводили до 2,0 МЕ / мл в соответствии с активностью, указанной на этикетке. Препараты SRIG оценивались в трех независимых испытательных партиях методами RFFIT и ELISA (Bio-Rad Platelia Rabies Kit II). Значение IU / мл было рассчитано по первому SRIG ВОЗ, а EU / мл было рассчитано по стандарту набора. Отображаются средние значения МЕ / мл или ЕС / мл с одним стандартным отклонением.

Расчет «метод результата» является дополнительным фактором, который необходимо учитывать при стандартизации анализа. Например, использование 50% или 100% конечных титров, которые могут быть рассчитаны для анализов нейтрализации сыворотки, приведет к различным значениям титра. Для любого сравнения результатов важно знать и всегда следует указывать, какой расчет использовался для получения значений титра.

Выводы

Важно, чтобы характеристики и изменчивость, связанные с различными методами анализа, которые определяют титры антител, продолжали определяться, поскольку мы продвигаем наше понимание иммунитета и профилактики заболеваний. Измерение специфических антител к бешенству in vitro имеет важное значение и должно быть первым шагом, предпринятым для определения успешности иммунитета против бешенства после вакцинации. Тем не менее, измерения in vitro никогда не могут полностью коррелировать с тем, что можно считать защитным in vivo. Даже использование «золотого стандарта» измерений активности нейтрализации вируса бешенства in vitro дает только оценку защиты. Несмотря на долгую историю использования тестов на нейтрализацию вируса, до сих пор не существует международно признанных стандартных протоколов для измерения антител, специфичных к бешенству, для конкретного определения эффективности RIG для биопрепарата человека против бешенства или для оценки перорального введения вакцины против бешенства в дикой природе. Стандартизация метода требует тщательного изучения и оценки результатов лабораторных испытаний, которые могут включать аудит лабораторных операций, публикацию и распространение стандартных рабочих процедур, а также межлабораторную и внутрилабораторную оценку квалификации при выполнении тестов. Проверка квалификации, обучение и сертификация, а также тенденции в проведении анализа являются компонентами программ обеспечения качества для обеспечения постоянного соблюдения признанных и принятых стандартов. Эти усилия потребуют сотрудничества всех организаций, проводящих испытания, включая национальные лаборатории, регулирующие органы, коммерческие компании, а также диагностические и исследовательские лаборатории по бешенству.

Для смертельного заболевания, такого как бешенство, где вакцинация и пассивный иммунитет (использование HRIG) абсолютно необходимы для защиты от воздействия, проверка точности и эффективности каждого анализа, связанного с прогнозированием соответствующей защиты in vivo от вируса, является жизненно важной. Кроме того, существует основное требование для подтверждения пригодности и применимости любой тестирующей системы нейтрализации или анализа связывания антигена, используемого в качестве предиктора защиты in vivo, с каждым новым типом профилактической биологии, будь то вакцина, Ig или моноклональное антитело рецептура. В случае вакцин необходимо понять, как антитела нейтрализуют вирусную инфекционность, чтобы внести вклад в разработку и представление иммуногенов вакцины, которые выявляют специфичность и изотип антитела, продуцируемого для обеспечения максимальной нейтрализации и, в конечном итоге, защитного действия. деятельность.

Вставка 1. Учебные очки

1. Было доказано, что РВНК имеет решающее значение для защиты от бешенства. Тем не менее, измерения in vitro являются лишь частичным определением степени защиты, обеспечиваемой in vivo. Не все методы, которые измеряют антитела, специфичные к бешенству, определяют нейтрализующую функцию антител.

2. При выборе наиболее подходящего анализа для выявления антител против бешенства, рассмотрение цели и использования результатов так же важно, как и установившаяся характеристика анализа.

3. Стандартизация анализов включает как компоненты анализа, так и условия испытаний. Изменения приведут к изменению результатов; поэтому использование определенного анализа (например, ELISA или нейтрализации сыворотки) не гарантирует сопоставимых результатов, если анализы не были стандартизированы.

4. Поскольку бешенство является смертельным заболеванием, для которого развитие достаточного ответа РВНК имеет первостепенное значение для защиты, специфичность анализа, чувствительность и точность должны быть проверены для принятия значимых клинических решений на основе результатов.

5. Шаги к лучшему пониманию и использованию серологических анализов на бешенство будут включать сотрудничество национальных лабораторий, регулирующих органов, а также коммерческих и исследовательских лабораторий. Более тесное сотрудничество и стандартизация серологических анализов на бешенство приведет к более глубокому пониманию взаимосвязи между измерением in vitro и защитой in vivo.

Вставка 2. Ключевые ссылки на местах

1. Smith JS, Yager PA, Baer GM (1973). Быстрый воспроизводимый тест для определения антител, нейтрализующих бешенство. Всемирный орган здравоохранения Булл 48: 535–541.

2. Cliquet F, Aubert M, Sagne L (1998) Разработка теста нейтрализации вируса флуоресцентного антитела (тест FAVN) для количественного определения антитела, нейтрализующего бешенство. J Immunol. Methods 212: 79–87.

3. Оберт М.Ф. (1992) Практическое значение антител к бешенству у кошек и собак. Rev Sci Tech 11: 735–760.

4. Грасси М., Ванделер А.И., Петерханс Е. (1989). Иммуносорбентный анализ с использованием ферментов для определения антител к гликопротеину оболочки вируса бешенства. J Clin Microbiol 27: 899–902.

5. Irie T, Kawai A (2002). Исследования различных условий нейтрализации вируса бешенства моноклональными антителами # 1-46-12 и # 7-1-9. J Gen Virol 83: 3045–3053.